Hinweis: Eine Schmelzkurvenanalyse ist nur mit interkalierenden Farbstoffen, z.B. SYBRGreen oder EvaGreen möglich, nicht jedoch mit Sonden!

Mit Hilfe der Schmelzkurve lassen sich die Spezifität einer SYBRGreen-qPCR bestimmen und eventuell auftretende Nebenprodukte detektieren. Es empfiehlt sich daher bei jeder qPCR dringend, eine Schmelzkurvenanalyse durchzuführen.

Zur Erzeugung der Schmelzkurve erhöht der qPCR-Cycler kontinuierlich die Temperatur und misst dabei gleichzeitig die Fluoreszenz. Diese fällt ab, sobald die Schmelztemperatur des während der qPCR hergestellten Amplikons überschritten wird.  Die Erklärung ist, dass beim Aufschmelzen des Produktes der interkalierte Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt wird, wodurch es zum Abfall des Fluoreszenzsignals kommt.

Achtung: Bei einem Wechsel des Mastermixes kann sich der Peak einer Schmelzkurve leicht verschieben. Das ist aber kein Grund zur Besorgnis, sondern eher zu erwarten: Die Schmelztemperatur hängt auch von der Salzkonzentration des im Mastermix verwendeten Puffers ab und es ist ziemlich wahrscheinlich, dass sich unterschiedliche Produkte in diesem Punkt unterscheiden!

Hinweis: Normalerweise wird die Schmelzkurve nicht direkt als Fluoreszenzkurve dargestellt, sondern als Funktion der Änderung der Fluoreszenz. Eine große Änderung der Fluoreszenz wird dann als Peak dargestellt und bedeutet, dass in diesem Bereich die Amplikons denaturieren. Eine spezifische qPCR zeigt immer nur einen einzelnen Peak. Mehrere Peaks sind – Ausnahme Multiplex-Assay! – ein deutlicher Hinweis auf unerwünschte Nebenprodukte. Diese erschweren eine saubere Interpretation und können u.U. das Resultat derart verfälschen, dass es unbrauchbar ist.

Hinweis: Bei einem Probe-Assay ist die Erstellung einer Schmelzkurve nicht möglich, da dazu die Verwendung eines interkalierenden Farbstoffes wie z.B. SYBRgreen notwendig ist.