Die Spezifität einer qPCR hängt im Wesentlichen ab von den Parametern:

  • Primerkonzentration
  • Annealing-Temperatur und Schmelztemperatur der Primer
  • Annealing-Zeit
  • Bildung von Primer-Dimer

Sollte Ihr qPCR-Assys nicht spezifisch genug sein, empfehlen sich folgende Maßnahmen:

  • Reduzieren Sie die Primerkonzentration

  • Erhöhen Sie die Annealingtemperatur – achten Sie dabei darauf, die Schmelztemperatur der Primer nicht zu übersteigen

  • Verkürzen Sie die Annealing-Zeit – durch diese stringenteren Bedingungen werden die “echten” Primer begünstigt

  • Falls alles nichts hilft, müssen die Primer neu designed werden – Variation von Länge, Schmelztemperatur, Sequenz. Gradientencycler!

Zur Überprüfung der Spezifität können Sie nach der qPCR den Reaktionsmix einfach auf ein Agarosegel laden oder – sofern Sie mit SYBRGreen arbeiten – nach der qPCR eine Schmelzkurve erstellen lassen. Diese zeigt Ihnen sofort, ob ungewünschte Nebenprodukte gebildet wurden.