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Kann ich problemlos auf einen anderen qPCR Mastermix wechseln?

Ja, Sie können problemlos auf einen anderen qPCR Mastermix wechseln – sogar mitten in einem Projekt oder einem Experiment! Einzige Voraussetzung ist, dass Sie vorher eine Normalisierung Ihrer qPCR durchgeführt haben, was sich aber ohnehin generell empfiehlt.

Wenn Sie folgende Regeln beachten, steht einem Wechsel des qPCR Master Mixes nichts im Wege:

  • Lassen Sie Ihre Negativ- und Positiv-Kontrollen parallel mit beiden Mastermixen laufen – nur so ist ein direkter Vergleich der Performance möglich
  • Schauen Sie sich die Fluoreszenzkurven an – gibt es Anzeichen auf eine PCR Inhibition?
  • Machen Sie cDNA Verdünnungsreihen, um sicherzustellen, dass die Dynamic Range identisch oder sogar besser ist als bei dem bisherigen Produkt
  • Überprüfen Sie, ob bei einem Wechsel des Master Mixes evt. Einstellungen an Ihrem Cycler geändert werden müssen

Weitere Informationen finden Sie unter Wie teste und optimiere ich eine qPCR? .

Welche Amplikonlänge ist optimal?

Die Robustheit, Sensititvität und Spezifität eines qPCR-Assays mit (Taqman) Sonden hängt stark von der Länge des Amplikons ab. Demgegenüber ist ein Assay mit SYBRGreen relativ unempfindlich gegenüber verschiedenen Amplikonlängen, wie aus Abbildung 1 ersichtlich.

Art des Assaysoptimale Amplikonlänge
TaqMan / Hydrolysesonden80 – 100 bp
Sondenbis 100 bp bp
SYBRGreen / EvaGreen120 – 200 bp

Abbildung 1a: Unterschiedliche Amplikonlängen innerhalb eines Assays sind zu vermeiden.

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Abbildung 1b: Taqman und SYBRGreen qPCR-Assays benötigen unterschiedliche Amplikonlängen

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Welche Reference/Housekeeping Genes sind die Besten?

Die Frage nach den besten Referenzgenen sollte für jede Zellinie/Anwendung einmalig untersucht werden.
Alternativ gibt es “Klassiker” unter den Referenzgenen, die sich in einer Vielzahl von Assays als stabile und robuste Kontrollen gezeigt haben.

Eine Übersicht bekannter Referenzgene finden Sie rechts, Sie können sich für weitere Details aber die folgenden Publikationen anschauen:

Ahrberg, C. D., & Neužil, P. (2015). Doubling Throughput of a Real-Time PCR. Scientific Reports, 5(1), 12595. https://doi.org/10.1038/srep12595

 

Gholami, K., Loh, S. Y., Salleh, N., Lam, S. K., & Hoe, S. Z. (2017). Selection of suitable endogenous reference genes for qPCR in kidney and hypothalamus of rats under testosterone influence. PLOS ONE, 12(6), e0176368. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0176368

 

Radonić, A., Thulke, S., Mackay, I. M., Landt, O., Siegert, W., & Nitsche, A. (2004). Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications, 313(4), 856–862. https://doi.org/10.1016/J.BBRC.2003.11.177

 

Kozera, B., & Rapacz, M. (2013). Reference genes in real-time PCR. Journal of Applied Genetics, 54(4), 391–406. https://doi.org/10.1007/s13353-013-0173-x

 

Gong, H., Sun, L., Chen, B., Han, Y., Pang, J., Wu, W., … Zhang, T. (2016). Evaluation of candidate reference genes for RT-qPCR studies in three metabolism related tissues of mice after caloric restriction. Scientific Reports, 6(1), 38513. https://doi.org/10.1038/srep38513
HGNC Symbol
GAPDH
PGK1
ACTB
HPRT
TUBA
HMBS
GUSB
RPL13A
YWHAZ
Β2M
TBP
PPIA
RPII
G6PDH
ALB

Wie viel Template brauche ich bei einer qPCR?

Typischerweise werden bei einer qPCR zwischen 1 und 10 ng Template pro Reaktion eingesetzt. Wieviel Template man für eine spezifische qPCR braucht, hängt von vielen Faktoren ab. Je nach Art und Weise der reversen Transkription kann zu viel Template die qPCR inhibieren. Am Anfang einer qPCR Optimierung sollte daher immer eine Template-Verdünnungsreihe über 5 bis 6 Potenzen (z.B. 0.001 ng, 0.01 ng, 0.1 ng, 1 ng, 10 ng)  stehen – so können Sie zuverlässig bestimmen, welche Menge an Template für Ihren Assay optimal ist.

Mit Hilfe der Verdünnungsreihe lassen sich generell folgende Parameter bestimmen:

  • Effizienz der Primer
  • qPCR Inhibition durch Template
  • Liegt meine Templatemenge im linearen Bereich der qPCR?

Hat man diese Parameter bestimmt, wählt man eine Templatemenge, die sich im linearen Bereich befindet.

Wie kann man die Spezifität der qPCR erhöhen?

Die Spezifität einer qPCR hängt im Wesentlichen ab von den Parametern:

  • Primerkonzentration
  • Annealing-Temperatur und Schmelztemperatur der Primer
  • Annealing-Zeit
  • Bildung von Primer-Dimer

Sollte Ihr qPCR-Assys nicht spezifisch genug sein, empfehlen sich folgende Maßnahmen:

  • Reduzieren Sie die Primerkonzentration

  • Erhöhen Sie die Annealingtemperatur – achten Sie dabei darauf, die Schmelztemperatur der Primer nicht zu übersteigen

  • Verkürzen Sie die Annealing-Zeit – durch diese stringenteren Bedingungen werden die “echten” Primer begünstigt

  • Falls alles nichts hilft, müssen die Primer neu designed werden – Variation von Länge, Schmelztemperatur, Sequenz. Gradientencycler!

Zur Überprüfung der Spezifität können Sie nach der qPCR den Reaktionsmix einfach auf ein Agarosegel laden oder – sofern Sie mit SYBRGreen arbeiten – nach der qPCR eine Schmelzkurve erstellen lassen. Diese zeigt Ihnen sofort, ob ungewünschte Nebenprodukte gebildet wurden.

Was ist der Ct oder Cq Wert?

Der Ct (Threshold Cycle) oder Cq (Quantification Cycle) -Wert wird in der qPCR als Maß für die Genexpression betrachtet und anhand der Fluoreszenzkurve bestimmt. Mit der sogenannten 2nd Derivative-Methode wird dabei die maximale Änderung der zweiten Ableitung der Fluoreszenzkurve bestimmt – also der Punkt, an welchem die Fluoreszenzänderung nicht mehr steigt – und damit die exponentielle Amplifikation beendet ist.

Den Zyklus, in dem dies der Fall ist, nennt man “Quantification Cycle (Cq)”.

Anmerkung: Die Berechnung des Cq-Wertes kann auch durch andere Methoden als die genannte erfolgen. Wichtig ist, dass für ein Experiment immer das gleiche Verfahren verwendet wird.

Eine Übersicht verschiedener Methoden finden Sie in dieser Publikation:

Ruijter, J. M., Zhao, S., Spiess, A. N., Boggy, G., Blom, J., Rutledge, R. G., … Vandesompele, J. (2013). Evaluation of qPCR curve analysis methods for reliable biomarker discovery: Bias, resolution, precision, and implications. Methods, 59(1), 32–46. https://doi.org/10.1016/J.YMETH.2012.08.011

Was ist die optimale Primerkonzentration?

Die Primerkonzentration hat einen maßgeblichen Einfluss auf die qPCR Performance und sollte daher in jedem Fall optimiert werden. Eine zu hohe oder zu niedrige Konzentration kann nachteiligen Einfluss auf die Berechnung des Cq Wertes haben und zudem die Bildung von Primer-Dimer begünstigen.

Im Normalfall kann man mit einer Primerkonzentration von 200-300 nM beginnen. Auf jeden Fall sollten dann in einem Testassay auch höhere und niedrigere Konzentrationen getestet werden, um das Optimum herauszufinden.

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Welche Kontrollen sind bei einer qPCR notwendig?

Wie bei jedem molekularbiologischen Experiment ist es wichtig, die richtigen Kontrollen bei jedem Assay mitlaufen zu lassen. Bei einer qPCR sind, je nach Assayformat, folgende Kontrollen ratsam:

  • noRT – Sollte als Template eine reverse Transkription (RT) aus mRNA verwendet werden, so sollte bei der RT ein Sample ohne Enzym als noRT Kontrolle verwendet werden.
  • No Template Control (NTC) – Für jedes analysierte Gen sollte eine NTC eingeplant werden, in welcher Wasser anstelle von Template verwendet wird. Die NTC wird genutzt, um Kreuzkontaminationen zu erkennen und sollte bei keiner qPCR fehlen.
  • Referenzgene (früher Housekeeping Genes) – Um eine robuste Genexpressionsanalyse zu ermöglichen, sollten mehrere Referenzgene für jedes Sample eingeplant werden. Die Expression der Referenzgene sollte unabhängig von einem Treatment sein und dient daher als Referenzpunkt für die spätere relative Quantifizierung.
  • Alternative Positivkontrolle – Für absolute Quantifizierungen, für die keine Referenzgene genutzt werden, sollte eine alternative Positivkontrolle verwendet werden, die in jedem Fall ein vorher bekanntes Ergebnis bringt.

Ist eine Schmelzkurve notwendig?

Hinweis: Eine Schmelzkurvenanalyse ist nur mit interkalierenden Farbstoffen, z.B. SYBRGreen oder EvaGreen möglich, nicht jedoch mit Sonden!

Mit Hilfe der Schmelzkurve lassen sich die Spezifität einer SYBRGreen-qPCR bestimmen und eventuell auftretende Nebenprodukte detektieren. Es empfiehlt sich daher bei jeder qPCR dringend, eine Schmelzkurvenanalyse durchzuführen.

Zur Erzeugung der Schmelzkurve erhöht der qPCR-Cycler kontinuierlich die Temperatur und misst dabei gleichzeitig die Fluoreszenz. Diese fällt ab, sobald die Schmelztemperatur des während der qPCR hergestellten Amplikons überschritten wird.  Die Erklärung ist, dass beim Aufschmelzen des Produktes der interkalierte Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt wird, wodurch es zum Abfall des Fluoreszenzsignals kommt.

Achtung: Bei einem Wechsel des Mastermixes kann sich der Peak einer Schmelzkurve leicht verschieben. Das ist aber kein Grund zur Besorgnis, sondern eher zu erwarten: Die Schmelztemperatur hängt auch von der Salzkonzentration des im Mastermix verwendeten Puffers ab und es ist ziemlich wahrscheinlich, dass sich unterschiedliche Produkte in diesem Punkt unterscheiden!

Hinweis: Normalerweise wird die Schmelzkurve nicht direkt als Fluoreszenzkurve dargestellt, sondern als Funktion der Änderung der Fluoreszenz. Eine große Änderung der Fluoreszenz wird dann als Peak dargestellt und bedeutet, dass in diesem Bereich die Amplikons denaturieren. Eine spezifische qPCR zeigt immer nur einen einzelnen Peak. Mehrere Peaks sind – Ausnahme Multiplex-Assay! – ein deutlicher Hinweis auf unerwünschte Nebenprodukte. Diese erschweren eine saubere Interpretation und können u.U. das Resultat derart verfälschen, dass es unbrauchbar ist.

Hinweis: Bei einem Probe-Assay ist die Erstellung einer Schmelzkurve nicht möglich, da dazu die Verwendung eines interkalierenden Farbstoffes wie z.B. SYBRgreen notwendig ist.

Wie bestimme ich die Effizienz der Primer?

Eine Effizienzbestimmung der Primer sollte grundsätzlich für jedes analysierte Gen durchgeführt werden.

Dafür erstellt man eine cDNA-Verdünnungsreihe über 5-6 Zehnerpotenzen und ermittelt die Cq-Werte für verschiedene Primerkonzentrationen. Aus der Steigung der erstellten Geraden lässt sich dann die Effizienz der jeweiligen Primerkonzentration ermitteln. Diese sollte zwischen 85 und 110 % liegen.