qPCR Optimieren

Startseite/qPCR Assay/qPCR Optimieren

Kann ich problemlos auf einen anderen qPCR Mastermix wechseln?

Ja, Sie können problemlos auf einen anderen qPCR Mastermix wechseln – sogar mitten in einem Projekt oder einem Experiment! Einzige Voraussetzung ist, dass Sie vorher eine Normalisierung Ihrer qPCR durchgeführt haben, was sich aber ohnehin generell empfiehlt.

Wenn Sie folgende Regeln beachten, steht einem Wechsel des qPCR Master Mixes nichts im Wege:

  • Lassen Sie Ihre Negativ- und Positiv-Kontrollen parallel mit beiden Mastermixen laufen – nur so ist ein direkter Vergleich der Performance möglich
  • Schauen Sie sich die Fluoreszenzkurven an – gibt es Anzeichen auf eine PCR Inhibition?
  • Machen Sie cDNA Verdünnungsreihen, um sicherzustellen, dass die Dynamic Range identisch oder sogar besser ist als bei dem bisherigen Produkt
  • Überprüfen Sie, ob bei einem Wechsel des Master Mixes evt. Einstellungen an Ihrem Cycler geändert werden müssen

Weitere Informationen finden Sie unter Wie teste und optimiere ich eine qPCR? .

Welche Amplikonlänge ist optimal?

Die Robustheit, Sensititvität und Spezifität eines qPCR-Assays mit (Taqman) Sonden hängt stark von der Länge des Amplikons ab. Demgegenüber ist ein Assay mit SYBRGreen relativ unempfindlich gegenüber verschiedenen Amplikonlängen, wie aus Abbildung 1 ersichtlich.

Art des Assays optimale Amplikonlänge
TaqMan / Hydrolysesonden 80 – 100 bp
Sonden bis 100 bp bp
SYBRGreen / EvaGreen 120 – 200 bp

Abbildung 1a: Unterschiedliche Amplikonlängen innerhalb eines Assays sind zu vermeiden.

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Abbildung 1b: Taqman und SYBRGreen qPCR-Assays benötigen unterschiedliche Amplikonlängen

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Wie kann man die Spezifität der qPCR erhöhen?

Die Spezifität einer qPCR hängt im Wesentlichen ab von den Parametern:

  • Primerkonzentration
  • Annealing-Temperatur und Schmelztemperatur der Primer
  • Annealing-Zeit
  • Bildung von Primer-Dimer

Sollte Ihr qPCR-Assys nicht spezifisch genug sein, empfehlen sich folgende Maßnahmen:

  • Reduzieren Sie die Primerkonzentration

  • Erhöhen Sie die Annealingtemperatur – achten Sie dabei darauf, die Schmelztemperatur der Primer nicht zu übersteigen

  • Verkürzen Sie die Annealing-Zeit – durch diese stringenteren Bedingungen werden die “echten” Primer begünstigt

  • Falls alles nichts hilft, müssen die Primer neu designed werden – Variation von Länge, Schmelztemperatur, Sequenz. Gradientencycler!

Zur Überprüfung der Spezifität können Sie nach der qPCR den Reaktionsmix einfach auf ein Agarosegel laden oder – sofern Sie mit SYBRGreen arbeiten – nach der qPCR eine Schmelzkurve erstellen lassen. Diese zeigt Ihnen sofort, ob ungewünschte Nebenprodukte gebildet wurden.

Was ist die optimale Primerkonzentration?

Die Primerkonzentration hat einen maßgeblichen Einfluss auf die qPCR Performance und sollte daher in jedem Fall optimiert werden. Eine zu hohe oder zu niedrige Konzentration kann nachteiligen Einfluss auf die Berechnung des Cq Wertes haben und zudem die Bildung von Primer-Dimer begünstigen.

Im Normalfall kann man mit einer Primerkonzentration von 200-300 nM beginnen. Auf jeden Fall sollten dann in einem Testassay auch höhere und niedrigere Konzentrationen getestet werden, um das Optimum herauszufinden.

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Wie bestimme ich die Effizienz der Primer?

Eine Effizienzbestimmung der Primer sollte grundsätzlich für jedes analysierte Gen durchgeführt werden.

Dafür erstellt man eine cDNA-Verdünnungsreihe über 5-6 Zehnerpotenzen und ermittelt die Cq-Werte für verschiedene Primerkonzentrationen. Aus der Steigung der erstellten Geraden lässt sich dann die Effizienz der jeweiligen Primerkonzentration ermitteln. Diese sollte zwischen 85 und 110 % liegen.

WIe bestimme ich die Primereffizienz?

Haben qPCR Platten und Folien einen Einfluss auf die Assay Performance?

Sowohl die Platten als auch die Folien können die Performance beeinflussen (Reiter 2008).
Weiße PCR-Platten (z.B. unsere primaPLATE SL-PP384-LC oder 4ti-0951) haben eine geringere Lichtstreuung und damit eine etwas höhere Signalstärke als transparente Mikrotiterplatten. Sobald man sich im Grenzbereich bewegt (sehr schwach exprimiertes Target/ wenig Probenmaterial), sollte man daher weiße Platten bevorzugen.

Auch die verwendete Folie hat einen großen Einfluss auf die Gesamtperformance des Assays. Hier ist unbedingt darauf zu achten, optisch klare Folien zu verwenden. “Normale” PCR Folien sind nicht zu empfehlen, da Klebstoffreste und Transparenzunterschiede im Material zu Inhomogenität beim Auslesen führen.  QPCR Folien gibt es in mehreren Ausführungen – es wird zwischen drucksensitiven Folien, stark klebenden Folien und Heat-sealing Folien unterschieden.
Drucksensitive Folien (z.B. primaSEAL qPCR-2) werden durch starken Druck auf die Mikrotiterplatte geklebt, wohingegen stark klebende Folien (z.B. primaSEAL qPCR-1) sofort und ohne größeren Anpressdruck die Platte sicher verschließen. Folien, die über Hitze auf die Platte aufgebracht werden, bieten zwar die größte Dichtigkeit, man benötigt aber einen separaten Heat-Sealer. Da die Seals aber günstiger sind als Klebefolien, amortisiert sich dieser bei größerem Durchsatz schnell.

Reiter, M., & Pfaffl, M. W. (2008). Effects of Plate Position, Plate Type and Sealing Systems on Real-Time PCR Results. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 22(3), 824–828. https://doi.org/10.1080/13102818.2008.10817561

Wie optimiere ich meine qPCR?

Für die Optimierung einer qPCR sind folgende Maßnahmen erfolgversprechend:

  • Check auf PCR Inhibitoren
  • Bestimmung der Primereffizienz
  • Bestimmung des Linear Dynamic Range (LDR)
  • Optimierung der Primerkonzentration
  • Optimierung der Templatemenge
  • Optimierung der verwendeten Consumables (Mikrotiterplatte, Folie)
  • Optimierung der Amplikongröße
  • Wechsel auf einen besser geeigneten qPCR Mastermix
Wie optimiere ich meine qPCR?

Wie stelle ich sicher, dass meine qPCR richtig funktioniert?

Nur ein sorgfältig validierter qPCR-Assay produziert verlässliche Ergebnisse!
Die MIQE Guidelines (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, Bustin 2009) geben einen guten Überblick, welche Parameter es hierbei zu beachten gilt und anhand welcher Daten man die Performance einer qPCR bestimmen kann.

Wir haben für Sie dazu eine übersichtliche Guideline zusammengestellt – Wie ermittelt und vergleicht man die Performance eines qPCR-Assays?

Nachfolgend eine Checkliste der wichtigsten Faktoren:

  • Ist meine RNA-Qualität ausreichend? (FragmentAnalyzer, Bioanalyzer, NanoDrop Kurve)
  • Wie gut ist die Primereffizienz? (Verdünnungsreihe!)
  • Liegt mein Amplicon im Linear Dynamic Range des Assays? (Verdünnungsreihe über 5-6 Zehnerpotenzen)
  • Wie groß ist die Variabilität/Robustheit der Replikate? (Biologische Replikate)
  • Bilden sich Primer-Dimer oder andere Nebenprodukte? (Gel, Schmelzkurve)
Wie optimiert man eine qPCR ? (Guide)

Wann brauche ich TaqMan Sonden – wann SYBRGreen?

Entgegen einiger Mythen steht ein guter SYBRGreen Assay einer Hydrolysesonde (TaqMan) für die Genexpressionsanalyse in nichts nach (Tajadini 2014, Cao 2012, Arikawa 2008). Entscheidend sind hierfür die Auswahl geeigneter Primer, ein entsprechend optimierter qPCR Mastermix sowie qualitativ hochwertige, nicht-fragmentierte cDNA – das gilt aber auch für TaqMan® Sonden.

Hydrolysesonden (TaqMan) sind besonders geeignet für SNP-Genotyping, Splice-Variant Analysen und für die Detektion von Mutationen mittels qPCR.

SYBRGreen-basierte Assays eignen sich hingegen hervorragend für die Genexpression oder miRNA Expression – also für den Großteil der Nutzer – und ermöglichen zusätzliche Qualitätsparameter, wie eine Schmelzkurve.

Wussten Sie schon, dass Sie bei uns qPCR Mastermixe sowohl für SYBRGreen als auch Sonden erhalten?

Weitere Informationen finden Sie in den folgenden Publikationen:

Tajadini, M., Panjehpour, M., & Javanmard, S. H. (2014). Comparison of SYBR Green and TaqMan® methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes. Advanced Biomedical Research, 3, 85. https://doi.org/10.4103/2277-9175.127998

 

Cao, H., & Shockey, J. M. (2012). Comparison of TaqMan® and SYBR Green qPCR Methods for Quantitative Gene Expression in Tung Tree Tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(50), 12296–12303. https://doi.org/10.1021/jf304690e

 

Arikawa, E., Sun, Y., Wang, J., Zhou, Q., Ning, B., Dial, S. L., … Yang, J. (2008). Cross-platform comparison of SYBR Green real-time PCR with TaqMan® PCR, microarrays and other gene expression measurement technologies evaluated in the MicroArray Quality Control (MAQC) study. BMC Genomics, 9, 328. https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-328
Nach oben