Newsletter Steinbenner Laborsysteme
steinbrenner_laborsysteme

Die perfekte qPCR: Worauf man wirklich achten sollte

[Anrede-Bedingungen]
Eine fluoreszenzbasierte, quantitative real-time PCR (qPCR oder RT-qPCR) wird längst nicht mehr nur zur Bestimmung der Genexpression genutzt, sondern auch für SNP-Analysen und miRNA-Expression. Es gibt einige Fallstricke und Fragen, die es für eine gute qPCR zu beantworten gilt. Worauf muss man bei einer qPCR achten? Woher weiß man, dass die qPCR zuverlässig ist? Wann nutze ich SYBRGreen, wann sind TaqMan®-Sonden von Vorteil?

Wir haben für Sie die wichtigsten Informationen in diesem Newsletter zusammengetragen - alternativ schauen Sie einfach im qPCR Knowledge Center vorbei.

Frage: Wann brauche ich TaqMan®-Sonden - wann SYBRGreen?

Entgegen einiger Mythen steht ein guter SYBRGreen Assay einer Hydrolysesonde (TaqMan) für die Genexpressionsanalyse in nichts nach (Tajadini 2014, Cao 2012, Arikawa 2008). Entscheidend sind hierfür die Auswahl geeigneter Primer, ein entsprechend optimierter qPCR Mastermix sowie qualitativ hochwertige, nicht-fragmentierte cDNA - das gilt aber auch für TaqMan®-Sonden. Hydrolysesonden (TaqMan) sind besonders geeignet für SNP-Genotyping, Splice-Variant-Analysen und für die Detektion von Mutationen mittels qPCR. SYBRGreen-basierte Assays eignen sich hingegen hervorragend für die Genexpression oder miRNA Expression - also für den Großteil der Nutzer - und ermöglichen zusätzliche Qualitätsparameter, wie eine Schmelzkurve.

Weitere Informationen sowie eine Liste von Tools finden Sie im qPCR Knowledge Center.


xx primaQUANT cybr 2x SYBRGreen Mastermix
Unser primaQUANT Mastermix für SYBRGreen Assays kombiniert eine exzellente Performance mit ausgezeichneter Sensitivität und Robustheit. Speziell entwickelt, sind selbst niedrig exprimierte Gene kein Problem. Vergleichen Sie die Performance mit Ihrem bisherigen Mix und erleben Sie, wie Sie Ihre qPCR noch besser machen können.
5 mL bzw. 400 Reaktionen à 25 µL ab 177,60 EUR
10 mL bzw. 800 Reaktionen à 25 µL ab 350,40 EUR
20 mL bzw. 1600 Reaktionen à 25 µL ab 688,00 EUR
Sonderpreise bei größeren Mengen verhandelbar.

Erfahren Sie mehr und fordern Sie Ihr kostenloses Testmuster an.
xx primaQUANT probe 2x Mastermix für Sonden
Unser primaQUANT probe Mastermix ist die perfekte Wahl für qPCR-Assays mit Sonden/TaqMan®. Nutzen Sie unseren Mastermix für alle gängigen Hydrolysesonden - auch TaqMan® und die Roche Universal Probe Library (UPL). Vergleichen Sie die Performance mit Ihrem bisherigen Mix und erleben Sie, wie Sie Ihre qPCR noch besser machen können.
5 mL bzw. 400 Reaktionen à 25 µL ab 176,00 EUR
10 mL bzw. 800 Reaktionen à 25 µL ab 338,40 EUR
20 mL bzw. 1600 Reaktionen à 25 µL ab 664,00 EUR
Sonderpreise bei größeren Mengen verhandelbar.

Erfahren Sie mehr und fordern Sie Ihr kostenloses Testmuster an.

Frage: Wie kann ich sicherstellen, dass meine qPCR gut funktioniert und zuverlässig ist?

Es gibt verschiedene Parameter, die Ihnen dabei helfen, die Performance Ihrer qPCR zu evaluieren und damit sicherzustellen, einen einwandfreien Assay zu verwenden. Die MIQE Guidelines (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, Bustin 2009) geben einen guten Überblick, welche Parameter es zu beachten gilt und welche Informationen nötig sind, um die Performance einer qPCR zu bestimmen.
Dabei gehört eine einfache Assayoptimierung zu den wichtigsten Faktoren:

  • Ist meine RNA-Qualität ausreichend?
  • Wie hoch ist die Primereffizienz? (Verdünnungsreihe)
  • Liegt mein Assay im Linear Dynamic Range? (Verdünnungsreihe über 5-6 Zehnerpotenzen)
  • Wie groß ist die Variabilität der Replikate?
  • Bilden sich Primer-Dimer oder andere Nebenprodukte? (Schmelzkurve)

Wir haben im qPCR Knowledge Center kurz umrissen, wie Sie diese Fragen am besten beantworten können und Ihren Assay optimieren.

Frage: Was ist ROX und benötige ich das wirklich? 

ROX (5-Carboxy-Rhodamin-X) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, welcher bei bestimmten qPCR-Maschinen als passiver Referenzfarbstoff zugegeben werden kann. Die Idee dahinter ist, Fluoreszenzunterschiede zwischen Wells, z.B. durch unterschiedliche Volumina, über die Messung eines passiven Signals herausrechnen zu können. Sollte Ihre qPCR-Maschine nicht mit ROX umgehen können, ist das kein Grund zur Sorge - eine gut optimierte qPCR benötigt keine zusätzliche Normalisierung durch einen passiven Farbstoff. Möchten Sie ROX nutzen, so achten Sie darauf, ob Ihre qPCR ROX in niedriger (low ROX) oder hoher (high ROX) Konzentration benötigt.

Eine Übersicht, welche Maschinen ROX benötigen, finden Sie im qPCR Knowledge Center.

Frage: Wie groß darf das Amplikon sein? 

Die Amplikonlänge ist bei einer qPCR ein wichtiges Kriterium und unterscheided sich für TaqMan und SYBRGreen Assays. Allgemein gilt:

  • TaqMan: Amplikonlänge zwischen 80 und 100 bp
  • SYBRGreen: Amplikonlänge zwischen 120 und 200 bp

Weitere Informationen zu Amplikonlängen und Primerkonzentrationen finden Sie im qPCR Knowledge Center.


xx primaQUANT Mastermixe gibt es ohne und mit ROX
Selbstverständlich erhalten Sie unsere qPCR Mastermixe entweder ohne ROX, mit niedriger oder hoher ROX Konzentration, so haben Sie für jeden Einsatzzweck den richtigen Mastermix.

Erfahren Sie mehr und fordern Sie Ihr kostenloses Testmuster an

Frage: Gibt es ein Standardprotokoll und wie berechne ich meinen qPCR-Ansatz?

Obwohl jeder qPCR-Assay individuell optimiert werden sollte (insbesondere die Primer), gibt es dennoch verschiedene Standardprotokolle, die den Einstieg in die quantitative PCR erleichtern. Durch die Verwendung von ready-to-use Mastermixen (z.B. unsere primaQUANT Mixe) müssen Sie in den meisten Fällen nur noch Ihre Primer und das cDNA Template zugeben. Wir haben für Sie einen qPCR Mastermix Calculator erstellt, mit dem Sie in wenigen Sekunden Ihren qPCR Ansatz ausrechnen können.
Natürlich haben wir für Sie auch gängige Standardprotokolle für 96-Well und 384-Well qPCR-Assays aufbereitet, diese finden Sie selbstverständlich im qPCR Knowledge Center.

Frage: Kann ich auch miRNA und lncRNA Expression mit einer qPCR bestimmen?

Anfangs wenig beachtet, sind microRNA (miRNA) und long non-coding RNA (lncRNA) wichtige Regulatoren der Genexpression und aktuell von höchstem Interesse. Die Expression von miRNA als auch lncRNA kann mittels qPCR genau quantifiziert werden (Lui 2013, Jiang 2014) - ähnlich zur normalen Bestimmung der Genexpression.
Um die Leistung der qPCR speziell für miRNA und lncRNA zu verbessern, haben wir den primaQUANT miRNA entwickelt. Die Verwendung ist einfach - nutzen Sie unseren Mastermix wie gewohnt - auch wenn das Template cDNA aus einer miRNA oder lncRNA ist. Weitere Informationen hierzu finden Sie im qPCR Knowledge Center.


xx primaQUANT miRNA 2x qPCR Mastermix
Unser primaQUANT miRNA ist ein SYBRGreen-basierter 2x Mastermix, der für die Expressionsanalyse von miRNA/lncRNA mittels qPCR empfohlen wird.

5 mL bzw. 400 Reaktionen à 25 µL ab 266,40 EUR
10 mL bzw. 800 Reaktionen à 25 µL ab 525,60 EUR
20 mL bzw. 1600 Reaktionen à 25 µL ab 1032,00 EUR
Sonderpreise bei größeren Mengen verhandelbar.

Erfahren Sie mehr und fordern Sie Ihr kostenloses Testmuster an

Frage: Haben qPCR Platten und Folien einen Einfluss auf die Assay Performance?

Ja, die verwendeten Platten und Folien können die Performance beeinflussen (Reiter 2008).
Weiße Assay-Platten (z.B. unsere primaPLATE SL-PP384-LC oder 4ti-0951) führen zu einer höheren Sensitivität durch geringere Lichtstreuung im Vergleich zu transparenten Mikrotiterplatten und sind deshalb bei Assays vorzuziehen.

Auch die verwendete Folie hat einen großen Einfluss auf die Gesamtperformance. Hier ist unbedingt darauf zu achten, optisch klare Folien zu verwenden - reguläre PCR-Folien sind nicht optisch klar und sollten bei einer qPCR nicht benutzt werden. QPCR-Folien gibt es in mehreren Ausführungen - es wird zwischen drucksensitiven Folien, stark klebenden Folien und Heat-sealing Folien unterschieden.
Drucksensitive Folien (z.B. primaSEAL qPCR-2) werden durch starken Druck auf die Mikrotiterplatte geklebt, wohingegen stark klebende Folien (z.B. primaSEAL qPCR-1) sofort und ohne größeren Anpressdruck die Platte sicher verschließen. Folien, die über Hitze auf die Platte aufgebracht werden, bieten zwar die größte Klebekraft, benötigen aber einen separaten Heat-Sealer und sind entsprechend teurer.


Alle in diesem Newsletter befindlichen Angebote sind bis zum 31.08.2018 gültig.
Preise zzgl. MWSt. und Fracht. Irrtümer und Druckfehler vorbehalten.
Es gelten unsere aktuellen AGB, einzusehen unter www.steinbrenner-laborsysteme.de

Referenzen

Tajadini, M., Panjehpour, M., & Javanmard, S. H. (2014). Comparison of SYBR Green and TaqMan® methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes. Advanced Biomedical Research, 3, 85. https://doi.org/10.4103/2277-9175.127998

Cao, H., & Shockey, J. M. (2012). Comparison of TaqMan® and SYBR Green qPCR Methods for Quantitative Gene Expression in Tung Tree Tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(50), 12296–12303. https://doi.org/10.1021/jf304690e

Arikawa, E., Sun, Y., Wang, J., Zhou, Q., Ning, B., Dial, S. L., … Yang, J. (2008). Cross-platform comparison of SYBR Green real-time PCR with TaqMan® PCR, microarrays and other gene expression measurement technologies evaluated in the MicroArray Quality Control (MAQC) study. BMC Genomics, 9, 328. https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-328

Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., … Wittwer, C. T. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

Reiter, M., & Pfaffl, M. W. (2008). Effects of Plate Position, Plate Type and Sealing Systems on Real-Time PCR Results. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 22(3), 824–828. https://doi.org/10.1080/13102818.2008.10817561

Liu, S.-P., Yang, J.-X., Cao, D.-Y., & Shen, K. (2013). Identification of differentially expressed long non-coding RNAs in human ovarian cancer cells with different metastatic potentials. Cancer Biology & Medicine, 10(3), 138–141. https://doi.org/10.7497/j.issn.2095-3941.2013.03.003

Jiang, X.-Y., & Ning, Q.-L. (2014). Expression profiling of long noncoding RNAs and the dynamic changes of lncRNA-NR024118 and Cdkn1c in angiotensin II-treated cardiac fibroblasts. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 7(4), 1325–1336. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24817929

Steinbrenner Laborsysteme GmbH
In der Au 17 · 69257 Wiesenbach · Deutschland
Fon +49 (0)6223 861247 · Fax +49 (0)6223 861248
mail@steinbrenner-laborsysteme.de

Geschäftsführer: Dr. Bernd Steinbrenner

Registergericht Mannheim HRB 336515
Sitz der Gesellschaft: Wiesenbach · USt-IdNr. DE 180969959