qPCR Optimieren und Testen

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Der Steinbrenner-Guide zur Optimierung Ihrer qPCR

Hier erfahren Sie Schritt für Schritt, wie Sie zu einem sauber etablierten und validierten qPCR-Assay kommen, auf dessen Ergebnisse Sie sich verlassen können.

Parameter zur Optimierung einer qPCR

Mit einem relativ einfachen Testassay können Sie schnell feststellen, ob und welche Parameter ggf. angepasst werden müssen. Dieser sollte folgendes enthalten:

  • No Template Control (NTC)
  • NoRT Control (noRT)
  • Verdünnungsreihe Template (5-6 Zehnerpotenzen)
  • Verschiedene Primerkonzentrationen

Primer

  • Schmelztemperatur
  • Amplikonlänge
  • Primerkonzentration
  • Homologe Regionen

Template

  • Templatemenge
  • RT Primer – Random / dT?
  • Reinheit der RT

qPCR Setup

  • SYBR Green oder Probe?
  • Annealing – Temperatur und Zeit
  • Extension – Temperatur und Zeit
  • Mikrotiterplatten – Weiß oder Transparent?
  • Reaktionsvolumen

Aufbau eines Testassays

Grundlagen zum Thema ROX

Manche qPCR Mastermixe enthalten zusätzlich einen internen passiven Referenzfarbstoff. Am bekanntesten ist hier ROX.

Viele Thermocycler verwenden ROX, um das Fluoreszenzsignal intern zu normalisieren: Aus dem Vergleich der ROX-Fluoreszenzwerte in jedem Well mit derjenigen des Reporters (TaqMan-Probe bzw. SYBR-Green) errechnet die Gerätesoftware einen korrigierten Wert für die Fluoreszenz (Rn-Wert). Auf diese Weise erreicht man eine Verringerung der Well-zu-Well-Varianzen und kann auch kleinere Pipettierfehler rechnerisch ausmerzen.

Hinweis

  • Aktivieren Sie möglichst, die ROX-Normalisierung Ihres qPCR Cyclers. Bei manchen Geräten, wie dem Roche Lightcycler 480®, ist die ROX-Option standardmäßig oft ausgeschaltet.
  • Am Markt sind Mastermixe mit unterschiedlichen ROX-Konzentrationen erhältlich, meist „Low ROX“ oder „High ROX“ genannt. Überprüfen Sie daher bitte unbedingt vor einem Test, welche ROX-Konzentration Ihr Gerät verlangt bzw. Ihr derzeitiger Mastermix enthält.

Assay Setup

  • Stellen Sie eine Serie von mindestens 5 Verdünnungsschritten Ihrer cDNA her (100%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01%)
  • Wählen Sie zum Testen Gene mit bekanntem – sowohl niedrigen als auch hohem – Expressionslevel (z.B. Referenzgene / Housekeeping Gene). Dadurch können Sie später ermitteln, bei welchen cDNA-Mengen Ihr Assay gut funktioniert („Dynamic Range“).
    .
  • Setzen Sie mindestens technische Triplikate an, um die Effekte von Pipettierfehlern oder anderen unspezifischen Variationen zu minimieren.

qPCR Mastermix – Protokoll

Komponente25 μl PCR-ReaktionFinale Konzentration
2x PCR Mastermix12,5 µl1 x
Forward primer (i.e. 5 pmol/µl)variable (i.e. 2 µl)0.1 – 0.2 µM    
Reverse primer (i.e. 5 pmol/µl)variable (i.e. 2 µl)0.1 – 0.2 µM    
Template DNAvariable0.1 – 10 ng/reaction
Sterile distilled wateradjust to 25 μl final volume

qPCR Mastermix – Zyklen

SchrittZeitTemperatur
Initial denaturation2-15 minutes1)92° – 95°C
25 – 35 cycles 2)
Denaturation2 – 10 seconds92°C
Annealing20 seconds55° – 68°C
Extensionvariable, depends on

length of PCR product

72°C

1) Initial denaturation depends on template amount, for larger amounts longer denaturation is recommended
2) When working with low copy numbers of template up to 10 cycles should be added

Effizienzbestimmung

Cq-Werte und Bestimmung der Primereffizienz

Bei der Beurteilung derAssayperformance sind neben der Schmelzkurve insbesondere die Cq (Ct)-Werte wichtig. Diese hängen direkt von der Menge an cDNA ab: Je mehr cDNA-Input, desto kleiner der Cq (Ct)-Wert. Nimmt man für ein ideales Gesamtsystem eine Effizienz von 100 % an, ergibt sich rechnerisch bei einer 10fachen Reduktion des cDNA Inputs eine Vergrößerung des Cq/Ct-Wertes um etwa 3.32 Zyklen (logarithmische Funktion!). In diesem Fall würden also die Amplifikationsplots der einzelnen 10fach-Verdünnungsstufen jeweils exakt 3,32 Zyklen auseinander liegen. Dass man diesen theoretischen Wert in der Praxis genau erreicht ist unwahrscheinlich – und auch nicht nötig. Da hier sehr viele Faktoren eine Rolle spielen (z.B. Primerdesign, Setup, Target Sequenz und PCR-Bedingungen), kann die errechnete Effizienz sogar  über 100% liegen, was natürlich nicht realistisch ist. Fazit: Mit Effizienzwerten zwischen ca. 90% und ca. 110% liegt man in der Regel im grünen Bereich und kann seinem Assay vertrauen.

Hinweis: Es gibt mehrere Verfahren zur Berechnung des Cq-Wertes. In der Regel erledigt diese das qPCR-Geräte automatisch. Sollte dies nicht der Fall sein, oder Sie sich für alternative Berechnungsmethoden interessieren, finden Sie hier eine Liste von Software/Tools.

Wie ermittelt man die Primereffizienz?

Man führt eine lineare Regressionsanalyse für die Verdünnungsreihe durch, indem man die Cq-Werte gegen die DNA Menge aufträgt. Dann ermittelt man die Steigung der Regressionsgeraden, in diesem Fall –3,479.

Aus diesem Wert lässt sich die Effizienz des getesteten Mastermixes mit folgender Formel berechnen:

Für das Beispiel rechts ergibt sich:

Wie oben ausgeführt, liegt dieser Wert in einem sehr guten Bereich und lässt auf eine gute Performance der qPCR für die gegebenen Settings schließen.

Hinweis

Es ist nicht oberstes Ziel, eine – rechnerische – Effizienz von 100% zu erreichen. Dieser Wert hängt maßgeblich von anderen Faktoren ab, die vom Mastermix unabhängig sind und ggf. einzeln optimiert werden müssen. Unter realen Laborbedingungen sind Effizienzwerte von 90-110 % als sehr gut anzusehen.

cDNA-inputMean Cq-value
100% (10 ng)18,54
10 % (1 ng)21,73
1 % (0.1 ng)25,1
0.1% (0.01 ng)28,6
0.01% (0.001 ng)32,5

Abbildung 1: Effizienzbestimmung über lineare Regression

In-Well Effizienz

Bestimmung der In-Well Effizienz

Die Berechnung der In-Well Effizienz kann nur durch Spezialsoftware/Tools erfolgen. Dazu sind die Rohdaten, nicht die erechneten Cq-Werte notwendig.

Tools zur Berechnung der In-Well Effizienz finde Sie in unserer Software-Übersicht.

Zusätzlich zur Primereffizienz – die wie oben beschrieben mittels einer Verdünnungsreihe ermittelt wird –  lässt sich auch die eigentliche PCR-Effizienz für jedes einzelne Well berechnen. Mit Hilfe dieser Berechnung lässt sich die Effizienz bei unterschiedlichen Template-Mengen berechnen und u.a. feststellen, ob eine Inhibition vorliegt.

Achtung: Zu dieser Berechnung müssen die Rohdaten (=gemessene Fluoreszenzwerte) verwendet werden. Die Cq-Werte sind nicht geeignet.

Im Idealfall sollte der Wert der Effizienz bei jeder Verdünnungsstufe des Templates in einem vergleichbaren Bereich liegen. Wie in der Abbildung 2 ersichtlich, ist dies bei dem getesteten primaQUANT CYBR-Mix auch der Fall. Das bedeutet, dass sich das Gesamtsystem (Mix, Primer, Setup) in einem harmonischen Gleichgewicht befindet und man den Ergebnissen absolut vertrauen kann!

Abbildung 2: In-Well Effizienz für verschiedene Template Mengen mit primaQUANT CYBR

Schmelzkurve

Ihr qPCR-Cycler erstellt eine Schmelzkurve, indem er die Temperatur kontinuierlich anhebt und gleichzeitig die Fluoreszenz misst. Schmelzkurven lassen sich nur bei Assays mit interkalierenden Farbstoffen wie z.B. SYBRGreen erstellen. (Bei Probe-Assays steht dieses wichtige Qualitätskriterium nicht zur Verfügung).

Die Schmelztemperatur hängt hauptsächlich von der Länge und der Sequenz des Amplikons sowie den Salzkonzentrationen ab. Sie steigt in der Regel mit der Amplikon-Länge an, ebenso mit dem GC-Gehalt.

Wichtig: Da der Verlauf der Schmelzkurve essentielle Informationen über die Spezifität der Reaktion liefert, ist eine Schmelzkurvenanalyse bei jedem Run und für jede einzelne Reaktion obligatorisch.

Bei einem gut eingestellten qPCR-Assay sollte nur das gewünschte Amplikon gebildet werden. Folglich dürfte in der Schmelzkurve auch nur ein Peak zu sehen sein. Bei unserem primaQUANT Mix (rote Kurve in Abbildung 3) zeigt die Schmelzkurve wie erwartet auch nur einen Peak, der zudem bei allen Verdünnungsstufen an derselben Stelle liegt. Die Schmelzkurve des Mastermixes eines Mitbewerbers (blaue Kurven in Abbildung 3) weist dagegen ausgeprägte Doppelpeaks auf. Ein klares Indiz für ein suboptimales Setup. Der zusätzliche Peak repräsentiert ein unspezifisches Nebenprodukt, höchstwahrscheinlich handelt es sich um Primer-Dimer.

Abbildung 3: Schmelzkurven einer Verdünnungsreihe mit zwei unterschiedlichen Mastermixen. Erläuterungen siehe Text.

Hinweis

  • Die Schmelztemperatur ist nicht als absolut zu sehen. Sie hängt u.a. auch vom Puffer eines Mastermixes ab (Salzkonzentration). Beim Wechsel auf einen anderen Mastermix kommt es daher in der Regel zu einem mehr oder weniger ausgeprägten Shift der Schmelztemperatur, jedoch keinesfalls zu Doppelpeaks.
  • Bei jedem qPCR-Assay sollte überprüft werden, ob der Peak in der Schmelzkurve tatsächlich das gewünschte Amplikon repräsentiert. Dazu trägt man die Proben nach der qPCR auf ein Agarose Gel (1.5 %-2 %, bei kleineren Amplikons auch höher) auf. Anhand des Laufbildes sieht man, ob das gebildete Amplikon dieselbe Größe wie das Target hat.
  • Falls die Schmelzkurve mehrere Peaks aufweist, sollte man unbedingt die Länge aller gebildeter Amplikons mittels Gelelektrophorese bestimmen. So kann man feststellen, ob man es mit Primer-Dimer zu tun hat, oder ob eine sonstige unspezifische Amplifikation stattgefunden hat.

Verbesserung der qPCR Spezifität

Primerkonzentration

Die Primerkonzentration hat einen großen Einfluss auf die qPCR Reaktion und sollte in jedem Fall angepasst werden. Generell gilt: eine niedrigere Primerkonzentration minimiert die Gefahr der die Bildung von Primer-Dimer. Die Polymerase in unseren primaQUANT-Mixen ist so aktiv und effizient, dass Primerkonzentrationen von 100-300 nM in der Regel völlig ausreichen. Probieren Sie dies bei der Validierung einfach aus und setzen Sie in Ihrem Assay nicht mehr Primer als nötig ein.

Wie in Abbildung 4 dargestellt, war in diesem Test für den zu optimierenden qPCR-Assay eine Primerkonzentration von 300 nM (Forward und reverse) optimal.

Abbildung 4: Unterschiedliche Primerkonzentration beeinflussen die Fluoreszenkurve – und damit auch den Cq Wert.

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Amplikonlänge

Die Länge des Amplikons ist entscheidend für die Robustheit, Sensititvität und Spezifität eines qPCR Assays.

Dies gilt insbesondere für eine sondenbasierte qPCR (z.B. Taqman-Assay). Assays mit SYBRGreen sind deutlich weniger empflindlich gegenüber der Amplikonlänge, wie in Abbildung 5/5b ersichtlich.

Art des Assaysoptimale Amplikonlänge
TaqMan / Hydrolysesonden80 – 100 bp
Sondenbis 100 bp
SYBRGreen / EvaGreen120 – 200 bp

Optimale Amplikonlänge für Sonden

Abbildung 5: Unterschiedliche Amplikonlängen innerhalb eines Assays sind zu vermeiden.

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112
Optimale Amplikonlänge für SYBRGreen

Abbildung 5b: SYBRGreen und TaqMan brauchen unterschiedliche Amplikonlängen.

Mikeska, T., & Dobrovic, A. (2009). Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription – quantitative real-time PCR assays. BMC Research Notes, 2, 112. https://doi.org/10.1186/1756-0500-2-112

Annealingtemperatur

Allgemein gilt: je höher die Annealing Temperatur, desto spezifischer die Reaktion.

Typischerweise wird das Annealing bei 60°C durchgeführt, d.h. die verwendeten Primer sollten eine Schmelztemperatur > 60°C besitzen. Es spricht jedoch prinzipiell nichts dagegen, die Temperatur zu erhöhen, z.B. auf 72°C, sofern man Primer verwendet, deren Schmelztemperatur darüber liegt.

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Jan Winter

Product Manager Genomics

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